Kako do Test za nukleinskih kislin

Testiranje nukleinskih kislin se izvaja v medicinski diagnostiki z namenom odkrivanja patogenov , kot so virusi in bakterije . Ti testi so veliko hitrejši in zato omogočajo zdravniku , da začnete zdravljenje bolnika, ki bi običajno morali počakati na potrditev okužbe z uporabo bolj dolgotrajni in dolgočasno testiranju na protitelesa . Postopek je znan tudi kot nukleinske kisline preizkus pomnoževanja , in vključuje metodo, imenovano " reverzne transkriptaze ojačitve" verižno reakcijo s polimerazo . Ker je tozelo specializirani znanstveni postopek , poglobljeno znanje in izkušnje v tehnikah za molekularno biologijo in je potrebna teorija . Tisto, kar potrebujete
epruvete PCR
PCR perioda
pipete in filtriranje nasveti
Rokavice
Celice
Trizol ali drugo ekstrakcijo RNA reagent
PCR pufer
Taq polimeraza
primerji RT- PCR pri koncentraciji 1 mg /ml jezik RNazo brez vodnih jezik dNTP jezik MgCl2 jezik Naključne primerji na 1,8 mg /ml, koncentracije jezik nadpisan II reverzne transkriptaze

Pokaži več navodil
predelava in priprava RNA
1

Harvest celic z ekstrakcijo RNA reagenta , kot Trizol . 1 ml , zadostuje za zbiranje celic v eno vdolbino šestimi vdolbinami za gojenje tkiva plošči . Celice so temeljito odpipetiranih navzgor in navzdol , da jih homogeniziramo in nato izvedemo postopek ekstrakcije , kot je opisano v podatkovnem listu Trizol . Na kratko , citat s kloroformom , nato centrifuga za ločevanje faz DNA , proteinov in RNA. Zopet le brezbarvni fazo RNA in oborino , ki z izopropanolom . Po inkubaciji , centrifuge , ki in čiščenje nastale pelete z več etanola opere . Nato resuspendirali pelet v RNazo proste vode.
2

reverzno transkripcijo , Denaturirati natanko 5 mikrogramov RNA v 65 stopinjah Celzija pri 10 mikrolitrov (UL) obsega RNazo proste vode , potem pa hitro položite na ledu . Za vsako reakcijsko zmešamo 10 ul RNA , 3 ul 10X PCR pufra , 2,5 ul 10 milimolaren dNTP , 6 l 25 milimolaren magnezijevega klorida , 1 ul naključnih oligonukleotidnih 1,8 miligrama na koncentracijo ml in 0,5 ul nadpisano II encimske reverzne transkriptaze . Dolijte vsako reakcijo z 17 ul RNase - proste vode . Inkubiramo epruvete pri sobni temperaturi, za deset minut in nato pri 42 stopinjah Celzija za eno uro , da dobimo cDNA , nato denaturira pri 95 stopinjah Celzija in hitro led ustavimo reakcijo .
3

za verižne reakcije s polimerazo , ponovno vzpostavi reakcijske zmesi v 0,5 ml epruvete s kombiniranjem 6 ul cDNA izdelan v reverzne transkripcijske reakcije, 1,5 ul 10X PCR pufra , 0,2 mikrolitrov Taq polimerazo 0,5 mikrolitrov reverzni začetni oligonukleotid in tudi terminskega temeljni premaz , nato napolnite vsako cev z 10,3 ul RNase - proste vode . Teči reakcije , vzpostavi toplotno ciklizatorja ( npr.stroj , ki deluje s polimerazo verižne reakcije ) za 30 ciklov , kot sledi : 95 stopinj Celzija , za 0,5 minuto denaturacije , ki mu sledi 60 stopinj Celzija za 45 sekund do žarjenjem , in na koncu 72 stopinj Celzija v 1 minuti za podaljšanje sintetizirano prepis .