Kako odpraviti težave Tri Fragment Ligation

Ligation jemetoda, uporabljena v biološke raziskave za vstop ločene sklope DNK. Proces je bila poenostavljena z uporabo komercialno dostopnih ligacijske kompletov. Postopek ligacija običajno sledi preoblikovanje , postopek vstavljanje združenih DNA v bakterijski vektorsko prejemnika , da klon in pomnoževanje DNA . Zaradi zahtevnosti metode , rezultati pogosto ne ujemajo z želenim izdelkom in zahteva odpravljanje težav . To je bolj prevladuje v poskusu, da se pridruži več fragmentov , na primer v trojni ligiranje . Tisto, kar potrebujete
komplet Ligation
Ligation protokol
agaroznem gelu
50 X TBA varovalnem ( 242 g Tris baze , 57,1 ml ocetne kisline , 100 ml 0,5 M EDTA razredči do 1 litra z vodo )
deioniziranevode
DNA čistilni komplet
Proste Prikaži več navodil
odpraviti težave preoblikovanju
1

oblikujejo seznam korakov pri ligiranje in transformacije . Odpravljanje težav nobenega znanstvenega protokola se navadno začne z zadnjega koraka , ki delajo nazaj .
2

Primerjava očiščen produkt DNA iz vzorca s kontrolno DNA, ki je priložena kompletu. Ko je DNA transformirana in klonirali v bakterijah , ga lahko izoliramo , očistimo in preverili z elektroforezo v agaroznem gelu. Rezultati za elektroforezo bi navedejo, ali je bila transformacija uspešna .
3

Ugotovite rast bakterij pri kloniranju . Večina bakterij vektorji so zgrajeni tako, samo tisti z vložkom DNK - bo rasla na mediju, ki vsebuje ampicilin ali drug antibiotik . Slaba rast lahko ugotovimo, da je vzorec DNA ni bilo uspešno vstavljena v vektor .
4

potrdimo, da je vzorec DNA ligiramo očistimo pred preoblikovanjem . Pufrskih soli in ligacijske encimi lahko zavirajo transformacijo vstavljene DNA . Prav tako je pomembno ugotoviti, da jeligacija encim inaktiviramo s toploto , po končanem postopku ligacije . Aktivna ligaza lahko potencialno vpliva na transformacijo .
5

Preverite datum na zalogi bakterij , ki se uporablja za transformacijo . Stare bakterijske celice izgubijo učinkovitost v daljšem časovnem obdobju . Sčasoma so bakterijske celice niso sposobne preobrazbe in kakovosti kloniranja . Ko je bila diagnosticiranaproces preoblikovanja , lahko začnete z analizo postopka ligacijskega .
Težav Ligation
6

Potrdite čistost svojega vzorca DNK , pred ligiranje . Onesnaževalci soli v vzorcu DNA lahko za posledico slabo ligacijo . Vzorec DNK mora biti očiščen in brez soli in encimi , preden jo uporabimo v ligaciji .
7

ugotovila, ali so konci verige DNA potrebno ligirati topo ali lepljiva . Ligation se uporablja za povezavo ločene sklope s topimi konci ali lepljivih koncev , po prebave z imenovanimi restrikcijskih encimov. Ligaze T4 DNA jeencim izbira za topo končnega DNK - vendar pa bo tudi delo za DNK z lepljivimi konci . Drugi ligaze DNA lahko le delo za DNK , poomejitev prebaviti ustvariti lepljive konce . Pomembno je, da se s pravilnim ligazo za DNA testirane .
8

Preveri koncentracija vzorcev DNA pred ligacijo . Uporaba DNA z visoko koncentracijo pogosto povzroči , da postanejo DNA linearna . Navodila kit bo zagotovil informacije o pravilnem znesku DNK za uporabo v ligacijski reakcijo .
9

ligazni encim zamenjajte z novo serijo. Encimi so še posebej občutljivi na sobni temperaturi in nadaljeval ciklih zamrzovanje-odtaljevanje . Ligaza se lahko poškoduje po številnih uporab , ki jih preprosto zmrzovanje in odtajevanje preveč krat . Nekateri kompleti priporočajo, da se ligaza alikvotih v manjših porcijah ob prvi uporabi , da se zmanjša število ponovitev pa je ponovno zamrznjeno .
10

Preverite komplet ligacijskega . Pogostoproblem z ligiranje uporablja kit, ki je potekla ali bila kontaminirana z drugimi DNA in soli .