Kako narediti Protitelo razredčitvam za IHC

Imunohistokemija ( IHK) jespecialist tehnika, ki jo znanstveniki uporabljajo za vizualizacijo celic v tkivih , ki so bili dani na diapozitiv in obarvajo z ustreznim protitelesom, ki prepozna beljakovino , ki je edinstvena v celico ali tkivo pod preiskava . Protiteles razredčitve ( titracije) , je treba opraviti z uporabo eksperimentalne pogoje, določene v uporabnikovem lastnega protokola , ne tega proizvajalca protitelo , sajsta morda ne bo enaka. Tisto, kar potrebujete
celice madež
protitelo
Pufer za redčenje ( " razredčila " )
pipete in nasvete
mikrocentrifugirko
aluminijasta folija
Lab označevalci in etikete cevi
ice
slide polje svetlobo zaščitena
Proste Prikaži več navodil

1

Preverite in pripraviti protitelesa . Preveri, ali jeprotitelo postavljeno v pravilnem gostiteljici , in reagira s točno različico proteina (znano kot izoforma, ali spoja variantne) , ki se preizkuša . S pipeto pazljivo vzemite 10 mikroliterskega del tega in oznako kot " osebno zalogi ".

Če so na voljo le zelo majhne količine protiteles , ta korak preskočite.

Vodenje osebnega zaloge protiteles je rutinska praksa v vseh laboratorijih , saj preprečuje navzkrižno kontaminacijo izvirnega zalogi. V vdolbinice to v svetli zaščiten mikrocentrifugirko , ali normalno mikrocentrifugirko , ki je zavit v aluminijasto folijo za zaščito pred svetlobo .

Naj bo to cev na ledu , prednostno v esky s pokrovom neprodušno , ponovno se zmanjša svetlobe , ki lahko uniči protitelesa . Zapišite koncentracije originalne baze (npr. 100 enot na mililiter , 1 miligram na mikrolitral in tako naprej ) na cevi , vključno z imenom protitelesa in kaj , če sploh, omilitev ga razredčenega v ( npr. v serumu , slane , ali voda , itd.)
2

Pripravite pufra za redčenje , znan tudi kot razredčila protiteles. Prepričajte se, da je to združljivo z protitelesa in postopek imunohistokemični , ki se uporablja , na primer, ne sme zamegliti nobene fluorescence ali prepovedovali poznejše označevanje sekundarna protitelesa . Naredite standardni imunohistokemija redčenje ( tudiblokiranje buffer ) z mešanjem 1X fosfatnim pufrom z 1% Triton-X100 , 10% fetalni telečji serum in 0,2% natrijev azid.
3

Titriraj protitelo . Z določeno koncentracijo protiteles v osebni zalogi ( izražena kot koncentracija enot, kot so mikrograma na mikrolitral ) , določitev količine protiteles , potrebno za pridobitev 10 mikrogramov protitelesa.

Nastavite serije redčenja s pipetiranjem prostornino enakovredna 2 mikrograma protitelesa (npr. X ul ), v 100 mikrolitri razredčila in dobro premešamo s pipetiranjem gor in dol . Iz tega startnega razredčenju sprejmejo enake X pl in dodaja, da na naslednjo 100 mikrolitri redčila . To ponavljajte , dokler 8-10 razredčitve ( ali serije ), ki je sestavljena .

Zadnja cev bo zato imajo najnižjo koncentracijo in biti" Vpojni " Koncentracija, ki bo ustvarila najvišji nivo signala v času poskusa. Vendar pa boidealno koncentracija nekoliko bolj koncentrirana kot to, da se ne preveč signalov proizvaja , kar lahko povzroči napake v ozadju .

Pravilno označimo cevi z novimi razredčenih koncentracijah.