Western Blot Navodila

Western blot analizo je dobro znano tehniko za ugotavljanje specifične proteine ​​izolirane iz tkiva . Različne proteine ​​predhodno ločeni s polnjenjem in teže na SDS - poliakrilamidnem gelu in prenesli na nitrocelulozno membrano . Po prenosu , označena protitelesa specifično vežejo z želeno proteina in jih fotografirali z uporabo rentgenskega filma ali vizualiziramo z proteinsko - specifičnega barvila . Končni rezultat kaže, temne pasove , ki kažejo na prisotnost znana beljakovin . Ta članek se osredotoča na osnovne metodologije za izvedbo Western blot analizo v laboratoriju , usposobljenega za kompleksne raziskave beljakovin . Tisto, kar potrebujete
SDS- poliakrilamidnem gelu ( SDS -PAGE ) z ločenim proteinov Neomejeno Nitrocelulozne membrano
destilirano vodo,
Prenos buffer ( 30 g Tris , 144 g Glycine in 200 ml metanola v 1 l voda)
Filtrirni papir , Whatman 3 mm
Laboratorij goba
Western Blot prenos komoro
Laboratorijski napajalnik
laboratorijska hladilnika
laboratorijske mešalo
Tris pufer s fiziološko raztopino (TBS ) ( 24,2 g Tris Base, 80 g NaCl v 1 l vode )
Blokiranje raztopino (5 odstotkov nemastno mleko v prahu v TBS )
Osnovna rešitev protitelesa
označenega konjugata protitelesa rešitev
alkalne fosfataze substrata rešitev z nitro modra tetrazolij madež
fosfatnim pufrom ( PBS )
Gel fotograf polje
Proste Prikaži več navodil
Prenos beljakovin Nitroceluloza membrana
1

Pripravite nitrocelulozni membrano . Membrana je treba namakamo v destilirani vodi dve minuti , nato postavi v pufru za prenos in pustimo namakati pet minut .
2

Zberite prenos sendvič , sestavljen iz goba /filtrirni papir /SDS STRANI /nitroceluloza membrane /filter papir /goba . Sendvič je postavljen takomembrana leži bližje anodo ingel bližje katode znotraj prenos komoro .
3

med transfer pufer v komoro tako jesendvič potopljen . Postavite komoro znotraj laboratorija hladilniku. Prenos proteinov iz gela na membrano je treba izvesti pri 4 stopinjah Celzija .
4

Nastavite napajalnik za prenos proteinov iz gela na membrano . Smer prenosa je proti anodi istega kabla naveden . Večji proteini hitreje premakniti v odziv na električni tok in se bo preselila najprej . Oskrba z električno energijo nadzira hitrost prenosa . Določiti moč do 30 V in 40 mA za prenos čez noč .
5

razstaviti napajalnik , ko je prenos končan . Ne priti v stik s pufrom za prenos ali odstranite sendvič , medtem ko je pritrjen napajalnik .
6

odstranite membrano iz sendvič in inkubiramo dve uri pri blokiranju rešitev. Proteinov v raztopini za blokiranje absorbirajo v membrano , kjer ni prisotnih proteinov . To bo preprečilo kakršno koli protitelesa iz vezave na membrano , kjer ni prisotenželeni protein .
Vezavas protitelesi
7

inkubiramo nitrocelulozni membrano z osnovno raztopino protiteles uporabo agitator . Membrana mora biti popolnoma potopljen v raztopino za najmanj eno uro . To je sprejemljivo, da se čez noč pustimo .
8.

operite membrano temeljito odstraniti nevezana protitelesa . Štiri ločene 10-minutne opere z TBS so običajno zadostuje , da odstranite odvečno protitelesa .
9

Inkubiramo membrano v označenega konjugata protitelesa rešitev s pomočjo mešalnika . Trebamembrane inkubiramo za najmanj eno uro . Označen konjugat protitelo je vezan na alkalno fosfatazo . To jeencim protiteles mešanica , ki bo prepozna in se veže na prvo protitelesa.
Odkrivanje Protein
10

izpirajte membrane za 10 minut v PBS štirikrat . To bo odpravilo v preostalem označenega konjugata protiteles.
11

Inkubiramo membrano v alkalni raztopini substrata fosfataza dokler se ne pojavijo pas vzorce . Barvila v raztopini substrata se veže na protitelo antigen - proteina v membrani in tvorita temno obarvani pas . Proces je lahko takojšnja ali zahteva do 30 minut, preden so opazili pasova .
12

Ovijte membrano popolnoma v celofan in jo postavite neposredno na gel - tipala za vizualizacijo rezultatov. Gel fotograf je sposoben fotografiranje rezultate, prikazane na Western Blot membrano .