Kako odkriti NADH

nikotinamid adenin dinuceltoide (NADH ) , skrajšano " NAD " , jekoencim najdemo v živih celicah , ki proizvaja kemične reakcije pri beljakovin. Farmacevtske družbe študija NADH zaradi njegove presnove procesu , in sintetično ustvariti za številne namene. Ker NADH je mikroskopsko majhnih,s prostim očesom ne more opaziti. Morate znanstvenih poskusov in analizni komplet za odkrivanje svojo prisotnost . Tisto, kar potrebujete
suhim ledom
Micro - centrifuge jezik Eppendorf cevi
Proste Prikaži več navodil
Reagent Rekonstitucija
1

Set kolesarski buffer na števec in pustite, dabuffer , da doseže sobno temperaturo . Idealna temperatura za pufra 22 stopinj Celzija .
2

pripravite NAD kolesarski encimsko mešanico z natanko 220 mikrolitri kolesarski buffer. Zamrzniti rešitev v temperaturah nahaja pod -70 stopinj Celzija .
3

pripravite razvijalec NADH z 1,2 ml ddH2O . Nežno zmešajte raztopino , dokler se popolnoma ne raztopi . Ne vortex .
4

Prašek v NADH standard z 200 ul čistega dimetilsulfoksida .
Priprava vzorca
5

Celice sprati z - fosfatni pufer s soljo .
6

Pellet 2x10 ( 5 ) celic za vsako posamezno testu v epruveti mikro centrifuge in vodijo pri 2000 RPM za 5 minut .
7

Izvleček celic z 400 ul NAD /NADH ekstrakcijskega pufra z zamrzovanjem in tajanje celice v dveh ciklih - 20 minut na suhem ledu in 10 minut pri sobni temperaturi . Vortexpridobljeni celice za natanko 10 sekund.
8.

Spin vzorce celic v mikro centrifugira pri 14.000 vrtljajih za natanko 5 minut.
9

Prenos NAD /NADH celice v čisto epruveto .
Vsebnost protokol
10

Razredčeni 10 pl standarda NADH z 990 ul NAD /NADH ekstrakcija odbojnikov . Med 0 , 2 , 4, 6 , 8, 10 , ul raztopine, razredčene v 96 vdolbinicami v dvojniku za ustvarjanje 0 , 20 , 40 , 60 80 , 100 ter standarda . Napolnimo zadnje vdolbinice s 50 mikrolitri NAD /NADH ekstrakcijskega pufra .
11

Prenos 50 ul izvlečka vzorcev celic s 96 vdolbinicami v dvojnikov kot prej .
12

Pripravite vzorce celic za odkrivanje NADH . Razpadejo NAD iz vzorcev celic z uvedbo 200 ul izvlečka vzorcev celic v Eppendorfove epruvete . Segrejemo cevi do 60 stopinj Celzija , za natanko 30 minut v temperaturno kontrolirano vodno kopeljo . Hitro ohladi vzorcev z dajanjem cevi na ledu . Spin vzorcev v mikro centrifuge za odstranitev oborine . Prenos 50 mikrolitri razgrajenih vzorcev v 96-kanalne plošče v dvojnikov kot prej .
13

Zmešajte NAD kolesarski buffer mešanico s 100 mikrolitri NAD kolesarski varovalnega spleta in 2 mikrolitri NAD kolesarski encima . Dodamo 100 ul te nove raztopine v vsako vdolbino NADH standardov in vzorcev .
14

inkubiramo ploščo na sobni temperaturi za natanko 5 minut . Ta proces bo pretvoril NAD v NADH .
15

Dodamo 10 ul NADH razvijalec v vsako dobro . Plošča se pusti sedeti pri sobni temperaturi najmanj 1 uro in največ 4 ure .
16

Preberite ploščo in izračun NADH .