Kako izvesti ELISA

ELISA ali encimsko immunoabsorbent testa , jebiokemični laboratorij tehnika narediti za odkrivanje antigen (npr. proteina ) ali protitelesa v poskusni vzorec . Test je izkoristil protitelesa, ki veže antigen, in se lahko uporablja testom drugo celico in molekularno vezanje mehanizme , kot tudi. Na podlagi beljakovin, ELISA ," kapitan " protiteles ali beljakovine je določena v testnem posodo in pustimo, da se držijo jed , po kateri" sonda " sredstvo (kot posameznikove beljakovin interesa ) je določena in inkubiranih z zajem sredstvom . Po več izpiranjih ," odkrivanje " protitelo Za prikaz prisotnosti ali odsotnosti protitelo - antigen ali protein , ki veže protein doda . Tisto, kar potrebujete
Analiza jed ( na primer 96 - ter skupinskih izjemah)
Capture protitelesa ( razredčena na 5 g /ml v 50 mM NaHCO2 , pH 9,6 ) jezik Probe protiteles /beljakovine ( razredčena na različne koncentracije )
detekcijsko protitelo ( npr. s hrenovo peroksidazo skupaj protitelo )
PT pufer ( 1x PBS , 0,05 odstotka Tween - 20 )
Blokirni pufer ( 1X PBS s 5 mg /ml BSA , ali 5 odstotkov posneto mleko v 1x PBS )
reagenta Detection ( tj. zmesi TMB reagent ) jezik strojništvo laboratorijskem mešalniku
Cold prostor ali hladilnik
pipetrom in nasveti
Proste Prikaži več navodil

1

razredčite zajem protitelesa za 5 g /ml v 50 mM NaHCO2 (pH 9,6 ). Dodaj 50ul vsako vdolbinico posode Vzorec za preskušanje . Pokrijte s plastike ali aluminija in pustimo čez noč pri 4 ° C v mešalniku .
2

Smetišče ven zajem protitelesa in operite dvakrat s 200 uL PT buffer. Dodamo 200 ul buffer blokado na vrtino ( PB ali 5 odstotkov posneto mleko) . Pustimo kjerkoli od dveh ur do noči , medtem ko stresanjem pri 4 stopinjah C.
3

smetišče ven pufru za blokiranje in operite 4-krat s 200 uL PT buffer. Dodaj " sonda " Vzorci beljakovinski pri različnih koncentracijah v PB ali 5 odstotkov, posnetega mleka in dodal 100 na jamico . Inkubiramo eno uro stresanjem pri 4 stopinjah C. Smetišče ven rešitev sonde in operite šestkrat s 200 uL PT buffer.
4

Dodaj specifičnih protiteles ( HRP protitelesa, konjugiranega ) razredčen 1:4000 v pufru PB ali 5 odstotkov posneto mleko ( eden, ki vsebuje 0,05 odstotka Tween - 20 ) , dodajanjem 50 uL na vzorce. Inkubiramo 30 minut do ene ure stresamo pri 4 stopinjah C.

5

Smetišče ven rešitev za odkrivanje protiteles in operite 6 -krat z 200 uL PT buffer na dobro , ki mu sledi umivanje dvakrat s 200 ul 1x PBS ( fosfatnega pufra s soljo ) . Izpisa iz PBS in dodamo 100 ul detekcijski reagent na jamico ( za HO , uporabo sveže mešano TMB reagent z mešanjem TMB substrat in peroksida 01:01 ) . Inkubiramo 15 minut pri sobni temperaturi , tresenje občasno .

pri uporabi TMB in HRP : Končno dodamo 100 ul 1M H3PO4 ( fosforna kislina) na jamico , da smo ustavili reakcijo KME

Read ploščo z bralnikom analizo vzorca , kot je 96- bralnik plošče . . (Za HRP in TMB , uporabitepredlogo " ELISA End -Point Analiza " na voljo v večini bralcev . )