Kako opraviti FRET Vsebnost

Fluorescenčni prenos resonančne energije ( FRET ) jetehnika, test za merjenje prisotnosti in količine vezave med dvema novinar povezana proteinov . Ta test se običajno uporablja za analizo potencialno vezavnih proteinov v različnih vrst celic , in za merjenje učinkovitosti konjugacije tipa encimov . Oprema za zaznavanjepotrebno v veliki meri odvisna od vrste sporočilne molekule , ki se uporabljajo , čeprav lahko večkratpreprosto 96 - tudi bralec ploščo je treba uporabiti. Tisto, kar potrebujete
Protein-of-interest/Reporter molekule konstrukti za vsako beljakovino , ki se preskuša
96- blok plošče
96- bralca plošča
reakcijskega pufra ( splošno Tris - ali Phosphate- temelji buffered saline )
Konjugiranje encim ( če je potrebno )
Prikaži več navodil
Setup in branje
1

Ustvari ali pripraviti fuzije konstrukte vsakega proteina obresti , pri čemer je vsak vezan na fluorescenčni prenosnim molekule , kot so zeleni fluorescentni protein ( GFP ) , Rodamina ali bor dipyrromethene ( BODIPY ) .
2

Določimo absorbanco in emisijskih valovnih dolžin vsake fluorescenčne sestavnega dela in skupni test . ( Na primer, čepreizkusom merila GFP -> transfer rodamin fluorescence energije ,vhod absorbance valovna dolžina je, da je GFP absorbance ( 488 nm) , in valovna dolžinaodkrivanje emisija je , da za Rodamina ( 595 nm ) )
.
3

ustvariti ustrezen reakcijski pufer za eksperiment , odvisno od proteinov biokemičnih lastnosti interesa je . Temelji TRIS pufer se pogosto uporablja , vključno s kalcijevim kloridom in 0,05 odstotka Tween - 20 . Posebne koncentracije in komponente se lahko določi z iskanjem dnevniških vnosov , ki podrobneje podobne reakcije in pogojev .
4

Zmešajte dve novinar konjugiranih proteinov obresti v različnih koncentracijah v reakcijskem pufru , in alikvot 50-200 na jamico . Dodaj Konjugacijski encim ( npr. sortase ) za vsak vzorec tudi , če je to primerno . Če opravlja končno točko testa je , omogočajo inkubacija pri sobni temperaturi (ali encima optimalno temperaturo ) za določeno časovno obdobje , potem glasi na 96- ploščnega čitalnika . Če izvajate kinetika testa , pojdite na obravnavi ( glej spodaj) .
5

Insert vzorčno ploščo v 96- bralnik tablice. Ustvariti nov poskus stran in odprete meni z nastavitvami. Vhodpravilne absorbance ( vzbujanje) in valovne dolžine emisij , izberite ustrezne vdolbinice treba brati .

Če izvajate poskus kinetike , določiti časovni potek poskusa in interval obdobje odčitki (na primer enkrat na 10 minut ) .

Začnite z branjem vzorec .

Analizirajte podatke z uporabo funkcije graphing Microsoft Excel (ali drugo graphing program, kot GraphPad ).