Kako meriti NADH

NAD in NADH sta piridin nukleotidi , ki sodelujejo pri presnovi. NADH in NAD najdenih v mitohondrijih koencimi , powerhouses celice. Oba NAD in NADH so vključeni v celičnih reakcij, kot so dihanje in fotosinteza , kjer so proizvedene energije in vodika . Biokemične reakcije NAD in NADH za gorivo, ki zahtevajo več encimov, ki proizvajajo ATP , je glavni vir energije v celicah . Tisto, kar potrebujete
celic ali tkiva v skladu s študijo
NADH analizni komplet
Phosphate- pufer s soljo
suhim ledom
Ogrevanje blok
96 vdolbinicami
Centrifuga
Označena cevi
plošča bralca
Vortex
Znan koncentracija NADH
Proste Prikaži več navodil
Vsebnost
1

operite celice ali tkiva v raziskavi z mrzlo fosfata - pufer , PBS . Izvleček celice ali narazen tkiva pri ekstrakcijskega pufra z dajanjem zmesi v suhem ledu 20 minut in nato pri sobni temperaturi 10 minut . Ponavljam . Na
2

Vortex 10 sekund. Spin v centrifugo za 5 minut na pelete celica ali tkivo naplavin . Supernatant odstranimo , tekočo fazo , in kraj tekočina v čisto epruveto .
3

Filter supernatant skozi specializirane filter za odstranjevanje encime, ki bo razdelitev NADH .
4

odstraniti 200 mikro litrov , poteka v čisto epruveto in toplote pri 60 stopinjah Celzija v grelno 30 minut denaturacije NAD . Cool in centrifuge in odstranite tekoče faze . Prenosne 50 mikro litrov v 96 vdolbinicami; vsak vzorec mora biti v dveh ali treh izvodih . Za določitev skupne NAD , NADt , ne segrevajo .
5

Pripravite in dodajte kolesarski mešanico z 96 vdolbinami. Mešamo in inkubiramo 5 minut . Med 10 mikro litrov razvijalec in pustimo inkubirati pri sobni temperaturi do 4 ure . Dodaj stop rešitev. Preberite barvno spremembo na bralca ploščo ali fluorimetru odvisno od kit.
Standardno krivuljo in izračun
6

Pripravimo standardno krivuljo ob znana koncentracija NADH ter razredčevanje v ekstrakcijskega pufra . Razredčimo v različnih koncentracijah , zagotavljanje obsega konec ostajaisti kot testnih vzorcev . Plošča na istem 96 vdolbinicami kot testnih vzorcev . Preberite optično gostoto .
7

Draw standardna krivulja graf s koncentracijo na osi X in optična gostota na Y osi. Vzemite v povprečju vsak testni vzorec in preberite koncentracijo od standardne krivulje grafa .
8

Izračuna se razmerje med NAD /NADH z odštevanjem celotne NAD , NADt , od NADH in nato deli s NADH .