Celični površini biotinilacijo protokol

biotinilacijo uporablja sposobnost vitamin, topen biotinom , da se veže na celičnih proteinov . Biotin veže na proteinsko streptavidin in je zato koristna v celične biologije Za prikaz celičnih proteinov . Biotinilacijo omogoča varno označevanje beljakovin v primerjavi s tehnikami, kot so radioaktivnost, in ne vpliva na normalno delovanje senzorja . To omogoča raziskovalcem za študij celičnih proteinov, kot so receptorji , in da omogoča boljše razumevanje bolezni in bolezenskih procesov . Označevanje suspendiranih celic,

Wash celice v ledeno mrzlo fosfatnim pufrom ( PBS ) , da se odstranijo nečistoče . Odbojniki , ki vsebujejo tris in glicin bo tekmovati z biotinilacijo in se je treba izogibati . Da bi se izognili biotinylating notranje proteine ​​, lahkooznačevanje lahko izvedemo pri 4 stopinjah Celzija ali v prisotnosti azida . Resuspendirali celice v PBS in topne biotina , sulfo -NHS - LC- biotin .
Označevanje prilepljenih celic

celice sprati v PBS in inkubiramo z izdelkom , kot sulfo - NHS - LC - biotina . Celice se nato postrgajo iztrebke v posodo in raztaplja v pufru, ki vsebuje detergent Triton -X 100 in pripravljena za vizualizacijo .
Priprava označiti celice

Po inkubaciji celice centrifugiramo v pelete in sprali v PBS . Celice smo resuspendirali v PBS in očistili s IgG Sepharose gela . Vezanega na beljakovine se razredči v pufru in segrejemo na 100 stopinj Celzija .
Vizualizacija celice

Popravljeni proteini lahko predstavljamo s pomočjo NaDS poliakrilamidna gelska elektroforeza ( SDS- PAGE ), čemur sledi pivnik s proteinom in encimske zmesi , streptavidin - hrenovo peroksida . Lise vizualizirajo s kemijsko reakcijo --- kemiluminescenci --- ki oddaja svetlobo . Specifičnost biotinilacijo se lahko potrdi s protitelesi za beljakovine v raziskavi.