Molekulsko kloniranje Protokoli

Molekularna protokoli kloniranje zajema postopkov , ki se uporabljajo za določanje meril, izolacijo in posnemajo zaporedja DNK . Tradicionalni omejitvijo in ligacijskih protokoli kloniranje sproži razdrobljenost DNK z omejenimi endonukleazami ( encimi , ki zadevajo DNK verig na restrikcijski mesti ), fragmentom DNA ligiranje (popravila zastojev v molekule DNK), transfekciji ( uvajanje nukleinske kisline v celice telesa) in izbor (izbiri posameznih genomov za replikacijo ) . Izolacija

protokoli za izolacijo DNA fragment ,prvi korak v molekulsko kloniranje , pogosto vključujejo verižne reakcije s polimerazo ( PMR ) , ki uporablja ciklov ogrevanja in hlajenja , da pomnožimo dele DNK. Da dosežejo velikost zaporedno cilj , drugi protokoli vključujejo soniciranjem DNA , reakcijo encima prebavo in uporaba kemično sintetiziranih oligonukleotidov . Ti protokoli se razlikujejo glede na obseg in količino izolirane DNA potrebna.
Ligation

Protokoli za ligiranje vključujejo uporabo encima , ligaze DNA , da se pridružijo molekule DNA skupaj z kovalentna vez . Protokol narekuje združevanje fragmente DNA, vektor za kloniranje , a ligacijskega blažilec, ligaze DNA in sterilno vodo v mikrocentrifugi cevi in inkubiramo čez noč pri 4 stopinjah Celzija .
Transfekcijo

protokoli za transfekciji ali vlivanje DNA v celico z uporabo ne- virusno sredstvo , pogosto vključujejo vbrizgavanje DNA neposredno v celično citoplazmo . Druge metode vključujejo uporabo kemičnih reagentov , kot so kalcijev fosfat in maščob, da poda transfekciji kompleks skozi celično membrano . Ta metoda preizkuša učinke genske spremembe na delovanje določenih genov .
Izbor

lig , ali prebiranje, protokoli ugotoviti , katere celice uspešno potekala vložek DNA in navede katere celice potrebujejo izolacijo . Centrifuge letine celice, ki vsebujejo transfektirane DNA , ki se jih nato inkubiramo v lizocima (naravno nastopajoč encim ) pufru in obdelamo z alkalnim čistilom , daje beljakovine in membrane topnost . Uporabo acetata za obarjanje proteinov ,centrifuga in sira i filtriranje supernatanta , ki vsebuje DNA (topni tekoči preostali od centrifugiramo spojine) . Supernatant oborimo s polietilen glikolom , centrifugirali in suspendiramo v cezijevega klorida in etidijevim bromidom pufra . Etidijev bromid madeži DNK glede na gostoto , in z uporabo UV svetlobe za dolgovalovno , jenižji -band DNA ekstrahiramo s petimi cc brizgi . Uravnotežimo ionsko izmenjevalno kolono loči DNK iz etidijevim bromidom in cezijevega klorida , inkončno pelet DNA , suspendirane v raztopini pufra zaznan in elektroforezo v agaroznem gelu .