Katere metode se lahko uporabijo za preučevanje interakcij protein-protein?

Za preučevanje interakcij beljakovin in beljakovin je mogoče uporabiti več metod. Tukaj je nekaj pogosto uporabljenih tehnik:

1. Koimunoprecipitacija (Co-IP) :Co-IP je široko uporabljena tehnika za proučevanje interakcij beljakovin in beljakovin. Vključuje imunoprecipitacijo ene beljakovine (beljakovine vabe) iz celičnega lizata z uporabo protitelesa, specifičnega za beljakovino vabe. Imunoprecipitirani proteinski kompleks se nato analizira, da se identificirajo druge beljakovine (proteini plena), ki medsebojno delujejo z beljakovinami vabe. Co-IP lahko sledijo različne metode nadaljnje analize, kot so Western blot, masna spektrometrija ali imunofluorescenčno barvanje.

2. Spustni testi :Pull-down testi temeljijo na principu afinitetne kromatografije. Protein vabe je imobiliziran na trdnem nosilcu (kot so magnetne kroglice ali agarozna smola) s kovalentno vezavo ali fuzijo z oznako (npr. GST ali His-tag). Celični lizat ali prečiščena beljakovinska mešanica se nato inkubira z imobilizirano beljakovino vabe. Po pranju, da se odstranijo nevezane beljakovine, se medsebojno delujoče beljakovine (proteini plena) eluirajo in analizirajo.

3. Fluorescenčni resonančni prenos energije (FRET) :FRET je tehnika, ki meri prenos energije med dvema tesno nameščenima fluoroforjema (donorjem in akceptorjem). Ko sta donorska in akceptorska fluoroforja v neposredni bližini (običajno znotraj 10-100 Å), povzroči vzbujanje donorske fluoroforje emisijo svetlobe akceptorskega fluoroforja. Ta prenos energije je mogoče kvantificirati in uporabiti za spremljanje interakcij med beljakovinami. FRET se lahko izvaja na različne načine, vključno z označevanjem proteinov s specifičnimi fluoroforji ali z uporabo gensko kodiranih fluorescenčnih proteinov (npr. GFP in RFP).

4. Analiza biomolekularnih interakcij (BIA) :BIA, znana tudi kot površinska plazmonska resonanca (SPR), je tehnika brez nalepk, ki meri spremembe lomnega količnika na meji med stekelcem in tekočo tekočino. Eden od medsebojno delujočih proteinov je imobiliziran na površini stekla, drugi protein pa se popelje čez površino. Interakcija med proteini vodi do sprememb lomnega količnika, ki jih je mogoče zaznati in kvantificirati. BIA lahko zagotovi informacije o vezavni afiniteti in kinetiki interakcij protein-protein.

5. Izotermalna titracijska kalorimetrija (ITC) :ITC je tehnika, ki meri spremembo toplote, povezano z interakcijo med dvema molekulama. Ko proteini medsebojno delujejo, se toplota sprosti (eksotermno) ali absorbira (endotermno). ITC lahko kvantificira vezavno afiniteto (Kd) in termodinamične parametre, kot sta sprememba entalpije (ΔH) in sprememba entropije (ΔS), interakcij protein-protein.

6. Proteinski interakcijski nizi :Nizi interakcij proteinov vključujejo visoko zmogljivo pregledovanje interakcij protein-protein v formatu mikromrež. Na tisoče različnih proteinov ali peptidov je imobiliziranih na trdni površini, vezava specifičnega proteina, ki nas zanima, pa se zazna z uporabo označenih protiteles ali drugih detekcijskih metod. Ta tehnika omogoča hitro in obsežno analizo interakcij protein-protein.

7. Dvohibridni (Y2H) test kvasovk :Test Y2H je genetska metoda, ki se uporablja za identifikacijo interakcij protein-protein v celicah kvasovk. Vključuje spajanje kodirnih sekvenc dveh proteinov na dve različni domeni transkripcijskega faktorja. Če oba proteina medsebojno delujeta, se transkripcijski faktor rekonstituira, kar vodi do izražanja reporterskega gena. Pozitivne interakcije so identificirane na podlagi rasti celic kvasovk na selektivnih medijih ali kolorimetričnih testih.

Izbira metode za proučevanje interakcij med beljakovinami je odvisna od specifičnih proteinov, ki nas zanimajo, razpoložljivosti reagentov in opreme ter želene ravni informacij. Kombinacije teh tehnik se lahko uporabijo tudi za pridobitev celovitega vpogleda v interakcije beljakovin in beljakovin.